圖像：冷凍FIB薄片——SEM和共聚焦熒光圖像的疊加。酵母細胞的靶結(jié)構（核孔蛋白Nup159-Atg8-split，紅色），用箭頭標記。比例尺：5µm[1].
本文介紹了如何利用冷凍光學顯微鏡，尤其是冷凍共焦顯微鏡來提高冷凍工作流程的可靠性。評估了EM網(wǎng)格和樣品的質(zhì)量，并分析了目標結(jié)構的分布。本文展示了如何將冷凍共焦3D數(shù)據(jù)投射到SEM圖像上，將感興趣結(jié)構可靠地保留在FIB切割的薄片內(nèi)，以便在冷凍TEM中進行進一步研究。
使用冷凍共聚焦顯微鏡定位核孔復合體
核孔復合體（NPC）是連接真核細胞核外膜和內(nèi)膜的大的蛋白質(zhì)組合體。NPC由幾百個核孔蛋白（NUP）組合而成，這些核孔蛋白形成一個中心通道，使分子能夠選擇性地進行核質(zhì)運輸：RNA和核糖體蛋白質(zhì)從細胞核運輸，而在細胞質(zhì)中翻譯的核蛋白質(zhì)、信號分子、脂質(zhì)等則穿梭到細胞核中。
為了更好地理解NPC的結(jié)構-功能關系以及它們的生物發(fā)生和轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)，以最高的分辨率在細胞內(nèi)部環(huán)境下研究它們的結(jié)構至關重要。圖1顯示了核膜冷凍電子斷層照片的組分分割圖[2]。斷層照片顯示，蛋白酶體與NPC結(jié)合，“在細胞核和細胞質(zhì)之間的通道上建立了蛋白質(zhì)降解樞紐"（Albert，S.等人，PNAS，2017年12月）。這清楚地顯示了冷凍電子斷層掃描（cryo ET）提供有關細胞結(jié)構和分子社會學的見解的方式。但是，如何用冷凍ET選擇性地檢查發(fā)生頻率低的罕見特定細胞事件，例如經(jīng)歷自噬的NPC？
圖1：冷凍電子斷層掃描的部分區(qū)域，顯示出細胞核周圍的原生細胞環(huán)境。蛋白酶體在兩個不同位置與核孔復合物（紫色）相連（橙色：膜栓系蛋白酶體，黃色：籃狀栓系蛋白酶體，藍色：游離蛋白酶體）。圖中還顯示了核膜（灰色）、核糖體（黑色/白色）和線粒體（紅色，帶有一排排黃色ATP合成酶）。數(shù)據(jù)由德國馬丁雷德（Martinsried）生化研究所分子結(jié)構生物學部門B. Engel博士提供。原出版物：Albert S, Schaffer M, Beck F, Mosalaganti S, Asano S, Thomas HF, Plitzko JM, Beck M, Baumeister W, Engel BD.“蛋白酶體連接到核孔復合體的兩個不同位點"[2]。
冷凍電子斷層掃描
冷凍ET是一種專用的透射電子顯微鏡技術，該技術采集一系列傾斜圖像，并重建觀察區(qū)域的三維體積（圖2）。隨著EM硬件和軟件的最新進展，可以實現(xiàn)亞納米級的分辨率。為了使樣品盡可能接近原生狀態(tài)，應將其快速冷凍，以避免破壞性的冰晶形成。產(chǎn)生這種無定形冰的過程稱為玻璃化。
圖2：冷凍電子斷層掃描技術示意圖。使用電子束（TEM）對樣本進行觀察，同時傾斜樣本，從不同觀察角度創(chuàng)建一系列圖像。3D立體容積得到重建，同時可對蛋白質(zhì)的分布進行可視化觀察與分析。
冷凍FIB研磨
只有厚度低于300nm的標本才能通過冷凍電子斷層掃描直接評估。較厚的樣品，例如用于NPC分析的酵母細胞核，必須通過銑削過程進行打薄。專用雙光束顯微鏡包括掃描電子顯微鏡和聚焦鎵離子束（冷凍 FIB-SEM），用于燒蝕不需要的材料（圖3）。
圖3：聚焦離子束銑削技術示意圖。使用掃描電子束觀察樣本，同時對樣本專門使用了聚焦離子束（FIB），以去除薄冰片（薄層）上方及下方的物質(zhì)。
在銑削過程中，去除感興趣區(qū)域上方和下方的材料，以產(chǎn)生200–300nm厚度的薄片。通過FIB研磨，之前無法檢測的厚細胞標本部分現(xiàn)在可以用于冷凍ET。
低溫光學顯微鏡
為了獲得特定細胞部位（如正在經(jīng)歷自噬的NPC）的斷層照片，必須在FIB研磨和冷凍ET期間確定感興趣的結(jié)構。由于在銑削之前或銑削過程中，大多數(shù)結(jié)構在SEM中無法清晰識別，因此需要一種在冷凍條件下可視化和定位感興趣分子的方法。
為了解決該問題，要使用冷凍熒光顯微鏡，例如使用THUNDER Imager EM cryo CLEM。使用基因編碼的熒光標記，可以可視化細胞中的特定靶點，并識別和標記感興趣的結(jié)構。接著，可以在后續(xù)的EM步驟中檢索圖像和xy坐標（圖4）。
圖4：靶區(qū)劃定與檢索。冷凍光學顯微鏡和FIB-SEM中的熒光酵母細胞。左圖：酵母熒光圖片，其中顯示了紅色的核仁和綠色的細胞壁。核仁由十字線標記。右圖：在FIB-SEM中檢索相同的位置，以創(chuàng)建包含感興趣細胞核的薄片。此處還顯示了初始銑削階段。薄層上下研磨窗口（黑色區(qū)域）可見。比例尺：10µm。圖片由P.Erdmann博士提供；酵母種株由F.Wilfling創(chuàng)建。馬克斯·普朗克生物化學研究所，德國馬丁斯里德。
當然，顯微鏡硬件必須始終保持樣品玻璃化?，F(xiàn)代寬場顯微鏡系統(tǒng)使用非常靈敏的攝像頭，甚至可以檢測微弱表達的蛋白質(zhì)。此外，通過應用最新的實時去除非焦面信號技術技術，可以解決寬場系統(tǒng)固有的難題，如離焦模糊。
然而，僅檢索感興趣結(jié)構的xy坐標是不夠的，z坐標也是必要的，以盡可能地使-靶結(jié)構包含在產(chǎn)生的FIB薄片中。然而，在寬場顯微鏡中，沿光軸的分辨率是有限的。
為了提高z分辨率，照理說下一步該選擇共聚焦。中間聚焦平面上的針孔會阻擋離焦光線，從而提高對比度和分辨率，尤其是沿z軸的對比度和分辨率（有關共焦原理的更多信息）。
