利用高分辨率顯微技術(shù)確定膜蛋白的位置
中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道位于神經(jīng)元突觸前后的膜室和突觸外膜室內(nèi)。這些蛋白質(zhì)的激活對(duì)突觸融合和調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放的影響取決于它們相對(duì)于突觸的精確位置，以及分子在細(xì)胞微隔室的密度大小和耦合效應(yīng)。因此，對(duì)膜約束受體和離子通道進(jìn)行高分辨率的定性與定量的可視化研究，對(duì)于理解它們?cè)诩?xì)胞通訊中發(fā)揮的作用至關(guān)重要。
神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的分子動(dòng)力學(xué)
神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)能力和環(huán)境適應(yīng)能力表明，從動(dòng)力學(xué)角度而言，神經(jīng)元具有改變其連接數(shù)量、類型和強(qiáng)度的基本能力。這些連接被稱為突觸，是突觸后神經(jīng)元和突觸前末梢之間高度有序的接點(diǎn)。特化的突觸膜包含大量分子，如受體、離子通道和相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白，其中精確的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)其發(fā)揮正常功能具有促進(jìn)作用。大量研究表明，這些蛋白質(zhì)的位置和它們相對(duì)于突觸的位置都會(huì)對(duì)其功能作用產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響。神經(jīng)遞質(zhì)受體位于神經(jīng)元突觸后區(qū)的突觸膜上，直接接觸釋放的神經(jīng)遞質(zhì)。
因此，受體瞬時(shí)激活，迅速產(chǎn)生突觸后反應(yīng)，與突觸前動(dòng)作電位之間具有精確的鎖時(shí)關(guān)系。相反，位于突觸外質(zhì)膜上的受體，遠(yuǎn)離突觸點(diǎn)，被溢出的神經(jīng)遞質(zhì)激活，產(chǎn)生抑制性電導(dǎo)，該電導(dǎo)與單個(gè)突觸前動(dòng)作電位之間并不存在精確的鎖時(shí)關(guān)系，而是以較慢的速度反映整體網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)[1]。受體也可位于突觸前，要么位于軸突末梢的突觸外膜上，要么位于突觸前網(wǎng)格上，由相同或相鄰的突觸扣結(jié)釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)所激活。與神經(jīng)遞質(zhì)受體一樣，離子通道也位于神經(jīng)元的樹(shù)突膜和軸突末梢上。突觸后通道通常在突觸輸入的融合與可塑性方面發(fā)揮作用，并通過(guò)介導(dǎo)緩慢的抑制性突觸反應(yīng)，增強(qiáng)靜息膜電位，來(lái)控制神經(jīng)元興奮。
集中于突觸前活性區(qū)或位于突觸扣結(jié)外膜的突觸前離子通道參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而在神經(jīng)元活動(dòng)的突觸前調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。因此，很容易理解，同一受體和離子通道針對(duì)細(xì)胞的不同亞細(xì)胞區(qū)室時(shí)可以滿足不同的功能要求 [1]。
此外，膜蛋白激活對(duì)突觸融合與調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放所產(chǎn)生的影響，主要取決于受體和離子通道在靶神經(jīng)元區(qū)室的密度大小和功能耦合，膜蛋白激活對(duì)受體和離子通道相對(duì)于興奮性和抑制性突觸點(diǎn)所處位置的影響也是同理。因此，問(wèn)題在于如何在高分辨率下精準(zhǔn)確定這些分子的亞細(xì)胞位置。
先進(jìn)的高分辨率免疫細(xì)胞化學(xué)方法
為此，下列先進(jìn)的高分辨率免疫細(xì)胞化學(xué)方法已得到廣泛應(yīng)用：
1
包埋前免疫膠體金法；
2
包埋后免疫膠體金法；
3
基于十二烷基硫酸鈉(SDS)的冷凍斷裂復(fù)型標(biāo)記(SDS-FRL)技術(shù)。
（1）在包埋前免疫膠體金法中，一個(gè)0.8nm或1.4nm的金顆粒與二抗發(fā)生耦合反應(yīng)，從而促進(jìn)適當(dāng)?shù)臐B透。隨后采用銀強(qiáng)化法，對(duì)金顆粒進(jìn)行強(qiáng)化，生成大小足以被檢測(cè)的顆粒。
由于這種方法生成了非擴(kuò)散性標(biāo)記，因此可以確定發(fā)生反應(yīng)的精確位置以及蛋白質(zhì)在突觸外和突觸周圍所處的位置。然而，我們無(wú)法利用這種方法檢測(cè)突觸蛋白，原因可能在于固定組織的特化突觸結(jié)構(gòu)中的抗原表位難以確定[2]。
（2）包埋后免疫膠體金法解決了包埋前技術(shù)存在的問(wèn)題。該方法使免疫化學(xué)品與暴露在超薄切片表面的抗原發(fā)生反應(yīng)，隨后采用與檢測(cè)非突觸分子相同的靈敏性檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)突觸蛋白。這種方法還改善了蛋白質(zhì)密度的定量評(píng)估。
但是，在樹(shù)脂包埋切片中，大量蛋白質(zhì)掩藏，無(wú)法確定抗體，如此便限制了這種技術(shù)的檢測(cè)靈敏度[2]。
（3）在SDS-FRL技術(shù)中，我們先用高壓冷凍儀（徠卡EM ICE）對(duì)腦組織進(jìn)行冷凍，然后使用復(fù)型儀（徠卡EM ACE900）對(duì)冷凍樣本進(jìn)行冷凍斷裂。蛋白質(zhì)會(huì)被分配到質(zhì)膜的原生質(zhì)面（P面）或外質(zhì)面（E面）。將分子固定在薄碳層（3-5nm）上，再進(jìn)行2nm厚的鉑/碳層鍍膜，遮住膜面，然后用15-20nm厚的碳沉積物強(qiáng)化這種材料[3]。與傳統(tǒng)的免疫膠體金法相比，SDS-FRL技術(shù)有兩個(gè)主要優(yōu)勢(shì)。
首先，SDS-FRL技術(shù)的靈敏度大大高于包埋前和包埋后技術(shù)，因?yàn)槟さ鞍妆┞队趶?fù)型品的二維表面（圖1），使其很容易接觸到免疫試劑。此外，SDS會(huì)使抗原表位發(fā)生變性，讓適合進(jìn)行免疫印跡解析的抗體與固定在復(fù)型膜上的蛋白質(zhì)發(fā)生相似反應(yīng)。其次，我們可以同時(shí)觀察到突觸蛋白質(zhì)和突觸外蛋白質(zhì)，并且可以在膜段中實(shí)現(xiàn)免疫膠體金密度的量化。
圖1：利用SDS冷凍斷裂復(fù)型標(biāo)記技術(shù)展示海馬細(xì)胞樹(shù)突中GABA（B1）和Kir3.2的分布和共定位分析。圖A：在一個(gè)假定錐體細(xì)胞的樹(shù)突軸（Den）和樹(shù)突棘（s）的表面上發(fā)現(xiàn)了GABA(B1)亞單位的免疫顆粒群（箭頭處）。圖B、C：Kir3.2（5nm顆粒；雙箭頭處）、GABA（B1）（10nm；箭頭處）和PSD-95（C中15nm）的雙重和三重免疫膠體金標(biāo)記顯示，這兩種蛋白質(zhì)在錐體細(xì)胞的樹(shù)突棘（B和C）中聚集，并與PSD-95（C）的免疫反應(yīng)所指的谷氨酸能突觸相關(guān)聯(lián)。比例尺:200 nm
與其他方法一樣，這種免疫細(xì)胞化學(xué)法也有一定局限性。首先，我們很難識(shí)別標(biāo)記的形態(tài)結(jié)構(gòu)，因此，有必要使用標(biāo)記蛋白，從而有助于識(shí)別經(jīng)過(guò)斷裂的膜[6]。其次，我們無(wú)法預(yù)測(cè)膜蛋白會(huì)分離到P面還是E面：有些蛋白優(yōu)先分到P面，如GABA（B1）、Kir3.2[4]，或分到E面，如AMPA受體[5]，而其他蛋白，如gluRδ2[6]，則同時(shí)定位于兩個(gè)面。因此，進(jìn)行定量研究應(yīng)仔細(xì)檢查分子的分配。
綜上所述，這三種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)提供了關(guān)于蛋白質(zhì)的細(xì)胞和亞細(xì)胞分布的補(bǔ)充信息，在高分辨率下對(duì)受體和離子通道在神經(jīng)元突觸前后區(qū)的定位和共定位問(wèn)題進(jìn)行定性定量分析時(shí)，這些技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)
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3. Fukazawa Y, Masugi-Tokita M, Tarusawa E, Hagiwara H, Shigemoto R: SDS-digested freezefracture replica labeling (SDS-FRL), in: Handbook of Cryo-preparation Methods for Electron microscopy, eds. Cavalier A, Spehner D, Humbel BM; CRC Press, New York (2009) 567–586.
4. Kulik A, Vida I, Fukazawa Y, Guetg N, Kasugai Y, Marker CL, Rigato F, Bettler B, Wickman K, Frotscher M, Shigemoto R. Compartment-dependent colocalization of Kir3.2-containing K+ channels and GABAB receptors in hippocampal pyramidal cells. J Neuroscience 26:16 (2006) 4289–4297.
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6. Masugi-Tokita M, Shigemoto R: High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr opinion in Neurobiology 17 (2007b) 387–393.
7.Fujimoto K: Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Journal of Cell Science 108 (1995) 3443–3449.
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